退火温度确定的计算公式是:4×(G+C)+2×(A+T)-(5~8)。
退火温度(AnnealingTemperature)是指引物和模板结合时候的温度参数,当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。
它是影响PCR特异性的较重要因素。
在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
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